Nagyítás, fénymikroszkópia, elektronmikroszkópia

Adódott egyszer csak az igény, hogy a természet apróbb dolgait is megfigyelhessük. Akik jól láttak, tudták, hogy kisebb is van annál, mint amit azok láttak, akik rosszul láttak, így felmerült persze, hogy biztosan van még annál is kisebb. Így lett a fénymikroszkóp. Is.

A poszt fizikai részének ellenőrzéséért, a tanácsért és a pontatlanságok javításáért köszi V. Tibi! 

Az írásban használt EM ábrákat és felvételeket újra és újra hálásan köszönöm Farkas Attilának a Magyar Molekuláris Medicina Kiválósági Központ (HCEMM) Fejlett Műszerparkja (Advanced Core Facilities - ACF) szegedi elektronmikroszkópos labor vezető kutatási asszisztensének. A felhasznált EM videó Kaló Péter tudományos főmunkatárs kutatócsoportja, a HUN-REN Szegedi Biológiai Kutatóközpont (HUN-REN SZBK) Szimbiózis és Növénygenomika Csoport kutatása során készült. 

Bár nagyon jól tudjuk, hogy az első mikroszkóp készítője Antoni van Leeuwenhoek holland textilkereskedő (könyvelő, üvegfúvó, földmérő, stb.) volt, az nem az első volt, és nem mikroszkóp. Legalábbis nem a szó szoros értelmében. Mikroszkópnak azokat az optikai eszközöket nevezzük, amelyekben legalább két nagyító lencse van, az objektív és az okulár lencsék. Az érettségire ezt kell tudni. Na Leeuwenhoeknak jó erős nagyításokat sikerült elérnie, de "egy lencsékkel". Mondhatjuk, hogy bazi erős nagyítókkal. Viszont már előtte – konkrétan az azt megelőző évszázadban – két szintén holland fickó, Zaccharias és Hans Janssen több lencsével dolgozott. Aztán Galilei 1609-ben a találmányukat továbbfejlesztette, fókuszálhatóvá tette. 1625-ben használták először a mikroszkóp kifejezést, majd 1632-ben megszületett Leeuwenhoek. Tény, hogy ő az "egy lencséivel" sokkal jobb eredményeket ért el, mint bárki más korábban, de azért mégsem csak ő volt ebben a sztoriban. Az azóta eltelt időben a fénymikroszkópia is nagyon sokat fejlődött, mint minden lényeges dolog a világon, de sajnos mindenre mégsem lett jó.

A hagyományos fénymikroszkópokkal nagyjából 200 nm-es felbontás érhető el, amivel viszonylag jól el lehet boldogulni a prokarióta sejtek, eukarióta sejtorganellumok (=sejtszervecskék) szintjén. Bár egyszerűen megfogalmazva a mikroszkóp teljes nagyítása a lencsék nagyításainak szorzatából adódik, és így elvileg a végtelenségig nagyítgathatnánk vele, a gyakorlatban ez a 200 nm-es felbontás megállítja a dolgot. Ennek oka (is) a fizikai optikában keresendő. Anélkül, hogy a bioszos részén túl valójában értenék hozzá, nézzük a lényeget nagyon egyszerűen.

Felbontási határnak hívjuk azt a legkisebb távolságot, amelyre elhelyezett tárgypontok még különálló képpontokként jelennek meg a képalkotásban. A felbontóképesség ennek a távolságnak a reciproka.

Ha ez (tárgypont/képpont) nincs meg, javaslom a Minimálfizika videósorozatból az Optikai lencsék c. epizód lelkes, csillogó szemekkel történő megtekintését.

De folytatva a dolgot, az átlagos egészséges emberi szem felbontási határa 0,1 mm az éleslátás optimális távolságán, ami hivatalosan 25 cm. Ez azt jelenti, hogy ha átlagos egészséges (fiatal felnőtt) szemünk van, akkor 25 cm távolságból az egymástól 0,1 mm-nél távolabb elhelyezkedő két külön pontot a szemünk még valóban külön pontokként érzékeli, ezen belül viszont már nem. Vagyis a 0,1 mm-nél nem kisebb/alacsonyabb/rövidebb tárgyat elviekben még képesek vagyunk élesen látni. Valójában a méret itt annyiban lényeg, hogy minél kisebb a tárgy, amit bámulunk, a látószög is annál kisebb, és minél kisebb a látószög, annál kevésbé látunk élesen. A látószög pedig a megfigyelt tárgy két egymástól legtávolabb eső pontjából húzott és a szem optikai középpontjában találkozó sugár által bezárt szög. Így:

A rajz persze nem arányos, mert láthatatlan volna, de a lényeg, hogy értsétek. Van egy pici sárga tárgyunk, aminek a magassága d=0,1 mm. A két végéről a szem irányába induló, és a szemlencse optikai középpontjában találkozó sugarak által bezárt szög az α, ami egyébként ilyen adatokkal 1' (= 1 szögperc). Ha a tárgy nagyobb (a zöld), akkor a két szélső pontjából induló sugarak által bezárt szög nagyobb lesz, tehát β > α. Vagyis jobban látjuk.

Na de ha valamit nem látunk, akkor azt nagyítjuk. Nyilván mindenki tudja, hogy kell használni egy egyszerű nagyítót (lupe), átnézünk rajta, és addig játszunk vele, amíg a mögötte tartott katicalárvát élesen látjuk. Ez konkrétan azt jelenti, hogy ebben az esetben nem a tárgy szemlencsétől való távolsága 25 cm, hanem a kép keletkezik ott (hiszen élesen látjuk).

A vizsgálandó tárgyat a nagyító lencse fókusztávolságán belül helyezzük el, és tehát az éleslátás optimális távolságán is belül. A róla a szem irányába haladó fénysugarak a lencsén megtörnek, és mivel gyűjtő lencséről van szó, az irányuk úgy változik, mintha irányváltoztatás nélkül messzebbről jöttek volna. Az alábbi rajzon a pici sárga tárgy felső szélső pontjáról induló fénysugarak útjából kettőt láttok, hogy követhető legyen. (piros színnel). A lencsén való törés utáni útjukat "visszafelé" kiegészítve (szaggatott vonalak) láthatjuk, hogy az elméleti kiindulási pontjuk messzebb van a lencsétől (25 cm), mint a valódi tárgyé, a keletkező kép nagyobb mint maga tárgy.

Nagyítóval kb. 30×-os nagyítást tudunk elérni azzal, hogy a látószöget nagyítjuk (=szögnagyítás). Minél közelebb tartjuk a szemhez a nagyítót, alapból annál jobb. A műszerészek és órásmesterek ezért néznek ki úgy, mint egy Borg.

Fénymikroszkóppal, ahogy írtam kb. 200 nm-ig láthatunk élesen. Ezalatt azért nem, mert a fénysugarak hullámtermészetéből adódó diffrakció (=elhajlás) miatt, a két külön pontból érkező fény már nem különíthető el egymástól. A diffrakció pedig a hullámhossztól (is) függ. Emellett vannak még egyéb bosszantó dolgok, mint a szférikus aberráció jelensége. A tökéletes lencse (az alábbi ábrán fent) minden végtelenből érkező sugarat az optikai tengely egyetlen pontjába, a fókuszpontba irányít, ahogy azt bioszból alapként kezeljük a gyűjtőlencsék esetén. Ezzel szemben egy gömbfelületekből álló valódi lencse (lent) az optikai tengelytől egyre távolabbi fénysugarakat egyre közelebb fókuszálja, így nem alakul ki tökéletes fókuszpont, a kép széle homályos lesz. Mindez nem túl kedves. És ez a rész az, amit most el is engedünk.

No tehát mindezek miatt ki kellet találni valami jobbat. Ez pedig az elektronmikroszkóp lett. Biológiában használjuk a sejt szintje alatti rendszerek részletes feltérképezésére, elég annyi, hogy a vírusok ezzel a technikával váltak mérgező folyadékból (lásd Ivanovszkij dohánymozaik kísérlete) dologgá.

Ebben a minta "megvilágítására" látható fény helyett gyorsított és fókuszált elektronnyalábot használnak. Hasonlóan a fénymikroszkópokhoz, itt is lehet "áteső fény" és "visszavert fény" alapján képet alkotni, ez a különbség a módszer és a gépek két alapvető változata között. Mindkét esetben elektronágyúval "lövik" és gyorsítják az elektronnyalábot a minta irányába, majd lencsékkel fókuszálják.

A pásztázó elektronmikroszkóp (= scanning electron microscope = SEM) a mintáról visszaszóródó elektronokat detektálja, míg a transzmissziós elektronmikroszkóp (= transmission electron microscope = TEM) a mintán áthaladókat.

A TEM vékony (iszonyat vékony), specifikusan előkészített minták, szövetmetszetek, vírusok felépítése, molekulaszerkezet vizsgálatára szolgál.

A SEM nagyszerűen használható felületek, kültakaró, sejtfelszín vizsgálatára, méret meghatározására. A fókuszált elektronnyalábbal végigpásztázzák a minta felületét. Ennek hatására a mintából nagyobb és kisebb energiájú elektronok, Röntgen sugarak, vagy akár fény lép ki, amelyeket a gép detektorai érzékelnek.

A detektált jeleket TEM esetében fluoreszcens ernyőn közvetlenül is meg lehet figyelni, de nagy általánosságban számítógépes szoftver alakítja képpé és nagyítja.

1. kép: Véralvadás: fibrinháló vörösvértestekkel
2. kép: Szőrszál felülete
3. kép: Baktériumkupac
4. kép: Golgi-készülék
5. videó: Nitrogénfixáló baktériumok gyökérgümőben

Az EM felbontási határát sok helyen még 0,5 nm-ben meghatározva látom, de sikerült már 0,1 nm-re is letornászni. Ha volna itt kis homály, csak mondom, hogy a nanométer a milliméter egymilliomod része. Sőt, ahogy az a Nature-ben (2018) olvasható, elektronmikroszkópia és krisztallográfia összedolgozásával, atomi szintű, 0,039 nm-es (0,39 Å) felbontási határt is értek már el! Ami nagyon durva, higgyétek el! Így aztán a biológiai mellett használható fizikai, kémiai vizsgálatokra is.

Az EM rendszerek ilyen mértékű felbontása annak köszönhető, hogy az elektronsugarak hullámhossza a látható fény nanométeres nagyságrendű hullámhosszával szemben pikométeres nagyságrendű (nm / 1000), így a diffrakció csak soooookkkal nagyobb nagyításnál válhat problémává, az aberráció kérdése pedig bár itt is sok évig tartó probléma volt, megoldották. Akit érdekel, hogyan, és tud angolul, annak javaslom a következő filmet az EM történetéről és technológiájáról. Nagyon jó.

Felhasznált források:

• What is Electron Microscopy? - https://www.umassmed.edu/cemf/whatisem/

• Lorenzo Metilli et al.: Latest advances in imaging techniques for characterizing soft, multiphasic food materials, Advances in Colloid and Interface Science, Volume 279, 2020 https://doi.org/10.1016/j.cis.2020.102154
• Electron images achieve record-breaking resolution - https://physicsworld.com/a/electron-images-achieve-record-breaking-resolution/

• Shibata, N., Kohno, Y., Nakamura, A. et al.: Atomic resolution electron microscopy in a magnetic field free environment. Nat Commun 10, 2308 (2019). https://doi.org/10.1038/s41467-019-10281-2

• Adam J M Wollman, Richard Nudd, Erik G Hedlund, Mark C Leake: From Animaculum to single molecules: 300 years of the light microscope, Open Biol. 2015 Apr 29;5(4):150019. doi: 10.1098/rsob.150019

• History of the Microscope - How the light microscope evolved.  https://www.thoughtco.com/history-of-the-microscope-1992146#:~:text=Birth%20of%20the%20Light%20Microscope%20About%201590%2C,much%20better%20instrument%20with%20a%20focusing%20device.

• Csajági és mtsai.: Gyűjtemény a fizika emelt szintű oktatásához, 2022 (ISBN 978-963-436-250-0)